practica 5 Sangre

Centro de Bachillerato Tecnológico

Industrial y de servicios No 155

Titulo: Sangre

Subtema: Recuento de electroncitos

Nombre: Estrada Alvarado José David

Grupo: 2LV (M)

Fecha:

Tijuana, Baja California a 26 de marzo del 2009

Maestro: Víctor Manuel Alfaro

Índice

Objetivo…

Recuento de electorcitos… 2,3

Técnicas de contaje celular… 4,16

Clases de cámaras… 17

Bibliografía… 18

Objetivo

El objetivo de esta tarea es el de conocer bien las funciones de la cámara de Neubauer y conocer cada tipo de cámara y saber para que se utiliza cada una de estas.

Recuento de electroncitos

Observa que en la gradilla de la cámara de Neubauer las áreas de encuentro de eritrocitos y linfocitos son diferentes. Los glóbulos rojos se encuentran en las áreas coloreadas de rojo, mientras que los glóbulos blancos se encuentran en las áreas de azul, ten en cuenta que la gradilla central tiene 25 cuadros de 1mm x 1mm de área y 0.10mm de profundidad. El factor de dilución es por tanto de 1:200, convierte el numero de glóbulos rojos contados en 5 cuadros al número de glóbulos rojos/ cul. (Microlito)= 1mm

¿Cómo se hace?

· Muy importante:

Cuando un territorio se sitúa en mitad de las líneas superior y/o de la izquierda, entonces es contabilizado 1ero no se sitúa en mitad de las líneas inferior y/o de la derecha.

El rango normal de recuento de glóbulos rojos es el siguiente:

Mujer: 3.9-5.6 millones /ud

Hombre: 4.5-6.5 millones /ud

Técnicas de contaje celular

Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido. Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión como el porcentaje de estas que son viables.

Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas desde la relativamente simple cámara de contaje celular de la gente existen numerosas variantes entre ellas la que empleamos (cámara de Neubauer), hasta equipos automáticos de contaje celular como el “cell coultor”, de la empresa Beckman Coulter.

Técnicas de cortaje celular

Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido. Habitualmente será necesario deteriorar tanto la densidad de las células en la suspensión como el porcentaje de estas que son viables.

Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas desde la relativamente simple cámara de contaje celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que empleamos (cámara de Neubaver), hasta equipos automáticos de contaje celular como el “cell Coulter”, de la empresa Beckman Coulter.

El principio del contador celular se basa en la medida de los cambios en la resistencia eléctrica que se produce cuando una partícula no conductora en suspensión en un pequeño electrolito atraviesa como pequeño orificio. Como se puede ver en el esquema una pequeña abertura entre los electrodesen.

La zona sensible atraves de la que pasan las partículas que se encuentran en suspensión. Cuando una partícula atraviesa el orificio desplaza su propio volumen de electrolito. El volumen desplazado es medido como un pulso de voltaje.

La altura de cada pulso es proporcional al volumen de la partícula. Controlando la cantidad de la suspensión que circula atraves del orificio es posible contar y medir el tamaño de las partículas. Es posible contar y medir por segundo varios miles de partículas independientemente de su forma, color y densidad.

En la unidad de citrometria de flujo y mocroscopio confocal de los científicos técnicos de la universidad de Barcelona, se dispone de contadores celulares.

Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando métodos mas sencillos. Nos basta con una cámara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensión a medir. El dispositivo presenta una señales que determinan un volumen conocido (x microlito). Al contar debajo de bajo el microscopio de partículas presentes en ese volumen se puede determinar la densidad de partículas en la suspensión de origen.

La cámara de Neubaver es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo cluro o al de contraste de frases. Se trata de un porta objeto con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se han marcado con la ayuda de un diagrama una cuadricula como la que se ve en la imagen. Es un cuadro de 3x3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25mm. Así pues el área sombreada y marcada.

La depresión central del cubreobjetos esta hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de la forma que cuando se cubre la superficie marcada 0.1 mly el volumen comprendido entre la superficie2 y el cubre objetos es de 0.1 ml cubico, es decir, 0.1microlitro.

En la imagen puedes observar el aspecto de una de las funciones marcadas con L y que en el microscopio se ve como una cuadricula de 16 pequeños cuadros de 0.25 mm, de lado.

Existen numerosos modelos de cámaras de contaje celular adaptadas en su uso en microscopio en la imagen puede observar una cámara de Neubaver doble, como las que se usan en laboratorio de prácticas. Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El más común es el de “tinción con azul tripan”. El azul tripan es un color que se introduce en el inferior de las células que presentan roturas en la membrana. Así pues, la célula que aparece en la imagen claramente de color azul. Son consideradas no viables. Asimilar células blancas por exclusión a células viables es un error pues por este método se sobre valora la viabilidad de las células en la suspensión determinado como inviable solo aquellas con la membrana rota.

Existen otros métodos de determinación de la viabilidad celular como el más preciso de la tinción con ioduro de propidio.

En la red dispones de descripciones detalladas como la propuesta por P.J. Hansen o la detallada descripción que aporta Beckdickson y los problemas de calculo de parámetros celulares que plantea empleando datos obtenidos a partir de un hemocitometro y otros protocolos para el contaje de células.

1. Se aseptiza el dedo con alcohol y luego se seca al aire o con algodón. Se coge entre el pulgar y el índice y se hace una punción rápida y penetrante a través de la piel de la punta del dedo con una lanceta estéril.

2. Se desecha la primera gota de sangre y se aspira la siguiente con la pipeta de dilución perfectamente limpia y seca hasta la señal 1 o 0.5 (también puede utilizarse la pipeta de hemoglobina, de 20 microlitros). Hay que evitar la entrada de burbujas de aire, pudiendo ayudarnos de un papel de filtro para conseguir el enrasado.

3. A continuación se toma con la pipeta líquido de Hayem, isotónico con la sangre, hasta la señal 1; así, la sangre queda diluida al 1/10, si tomamos sangre hasta la señal 1, o al 1/20 si tomamos hasta 0.5. Esto es así porque el volumen de la bola de la pipeta es 100 veces superior al del capilar de la misma. (Si hemos utilizado la pipeta de hemoglobina podemos diluir su contenido en 2 o 4 ml de líquido de Hayem para obtener diluciones 1/100 o 1/200).

4. Tomamos la pipeta (o el tubo de ensayo) entre los dedos índice y pulgar y agitamos. A través de la goma de conexión con la pipeta, soplamos para despreciar las primeras gotas por corresponder al líquido que estaba en el capilar.

5. Se adapta un cubreobjetos sobre una cámara cuentaglóbulos limpia y seca y se coloca una gota en uno de los lados del cubre; esta gota penetra por capilaridad y rellena el retículo de la misma.

6. . Una vez preparada la cámara se coloca sobre la platina del microscopio dejándose unos minutos en reposo para que sedimenten los glóbulos. Disponemos el condensador bajo y luz débil; enfocamos primero con el objetivo débil seco y luego se cambia al fuerte seco para proceder al recuento, que se lleva a cabo en los cuadrados pequeños del retículo marcado en color rojo. Finalizado el recuento se procede a la limpieza de la pipeta con acético 1:3, agua destilada y alcohol-éter sucesivamente.

7. El volumen de sangre en el cual se han contado las células resulta de multiplicar la profundidad de la cámara por el factor de dilución, la superficie de los cuadrados y el número de cuadrados contados.

Con cámara de NEUBAUER: Superficie de 1 cuadrado grande (1/20 mm de lado):

Volumen de un cuadrado grande (1/10 mm de profundidad):

Si contamos "a" glóbulos rojos en "n" cuadrados pequeños, el número de glóbulos por cuadrado será a/n.

Si en un volumen 1/4000 mm³ hay a/n glóbulos rojos, en 1 mm³ habrá X. Luego:

siendo X el número de glóbulos rojos existentes por cada mm³ de sangre diluida.

Si la sangre se diluyó a 1/100 o 1/200, habrá que multiplicar el valor X por 100 o 200 respectivamente, con lo cual obtendremos un nuevo valor, Y, que representa el número de glóbulos rojos existentes por cada mm³ de sangre (sin diluir).

1.

a) se pipetea una suspensión de células en el porta, en el borde del cubre, rellenando la cámara de recuento por capilaridad. En unos minutos sedimentan las células en el fondo y se puede empezar en recuento.

b) Se cuentan las células bacterianas de uno de los 25 cuadros de mayor tamaño; en este caso solo hay 12 bacterias. En la practica se cuentan las bacterias de varios grandes y se hace la medida. El numero en el cuadro grande multiplicado por 25 es el numero en 0.02mm cubicos. El numero multiplicado por 50 es el numero en 1 mm cubico. Este numero multiplicado por 100 es el numero en un mililitro (un centímetro cubico). En este caso :12x25x50x1000=1.5x10(cubico)células/ml. Si se encuentran las células de un cuadrado pequeño, el numero se multiplica por un factor de 16(16x25x50x100=20000000).

c) Se utilizan para calcular, mediante el uso del microscopio, el número de partículas (leucocitos, hematíes, bacterias…) por unidad de voluimen de un líquido.

d) La cámara está constituida por una placa base de vidrio especial parecido a un porta, su parte central se encuentra separada de los extremos por unas ranuras. en ella se encuentran las cuadrículas de recuento.

e) La fórmula de contaje es: partículas/mm3= partículas contadas.

Clases de cámaras

- Neubauer improved: Es el más utilizado (9 cuadros grandes, cada 1 de 1 mm2.)

- Neubauer: La diferencia es el cuadro grande central.

- Thoma: Se utiliza solo para el recuento de eritrocitos.

- Fuchs-Rosenthal: Se utiliza habitualmente para recuento de células en líquidos orgánicos (LCR, Líquido sinovial…)

Cámara de Neubauer.

Es un instrumento utilizado en cultivo celular para realizar conteo de células en un medio de cultivo líquido.

Consta de 2 placas de vidrio, entre las cuales se pueden alojar un volumen conocido de liquido. Una de las placas posee una grilla de dimensiones conocidas y que es visible al microscopio óptico. Para contar las células de un cultivo liquido se agrega una gota de este eutre, estas dos plásticas y observar al microscopio óptico la cantidad de células presentes en un campo determinado de la grilla.

En base al a cantidad de células contadas conocidas, el volumen de liquido que admite el campo de laq grilla se calcula la concentración de células por unidad de volumen de la solución de medio de cultivo inicial.

Se usa para el recuento de leococitos y de glóbulos rojos.

Para la pipeta para blancos con sangre capilar anticuagulada se diluye la muestra con el liquido y se deja reposar 10 min. Para que se homolicen los eritocitos, se llenan ambos lados de la cámara, se enfoca con poco aumento los leucocitos aparecen con continuos celulares cloros y núcleos bien definidos.

Para poder realizar las practicas el alumno debe contar con su equipo de bioseguridad como es; bata blanca, gorro, cubre bocas y guantes de látex desechables.

Bibliografía

La mando el profesor Manuel Alfaro por correo electrónico 26-03-09.