OBSERVACION MICROSCOPICA BACTERIOLOGICA DE MEDIO DE CULTIVO practica No.4
1-Nombre del medio: agar salmonella y shiga. Nombre de la siembra: siembra de sigsne Nombre de la muestra: sangre sentrifugada Observaciones:en este medio no a habido resultados de colonias mas que Vapor de agua . 2- Nombre del medio: agar verde brillante Nombre de la siembra: siembra por dispersión Nombre de la muestra: orina (no centrifugada) Observacuiones: no hubo resultados solo las marcas de la siembra. 3- Nombre del medio: agar de hierro de kligler Nombre de la siembra: siembra de tapis Nombre de la muestra: h2o de lechugaObservaciones: en esta caja hubo crecimiento de ongos de la lechuga. 4- Nombre del medio: agar de mac conkey Nombre de la siembra: siembra exagonalNombre de la muestra: muestra interdental Observación: en esta muestra hay pequenos puntitos de caries. 5- Nombre del medio: agar dextosa Nombre de la siembra: siembra por estrias Nombre de la muestra: raspado de piesObservación: vapor de h2o y pequenas manchitas.
DesarrolloEl día 28 de mayo del 2008 observamos a simple vista las siembras y tomamos no ta de cada una de allas. Nosotros como alumnos debemos observar como estan las colonias de bacteriasque crecen de 24 a 72 hrs.
La extracción de sangre es un procedimiento médico muy usual para la detección de posibles enfermedades al realizar los oportunos análisis a la muestra de sangre obtenida. La sangre se extrae de una vena, usualmente de la parte interior del codo o del dorso de la mano. El sitio de punción se limpia con un antiséptico y luego se coloca una banda elástica o un brazalete de presión alrededor del antebrazo con el fin de ejercer presión y restringir el flujo sanguíneo a través de la vena, lo cual hace que las venas bajo la banda se dilaten. Inmediatamente después, se introduce una aguja en la vena y se recoge la sangre en un frasco hermético o en una jeringa
Durante el procedimiento, se retira la banda para restablecer la circulación y, una vez que se ha recogido la sangre, se retira la aguja y se cubre el sitio de punción para detener cualquier sangrado. En función del tipo de análisis que se vaya a realizar es requisito haber suspendido el consumo de alimentos al menos ocho horas antes de la extracción; aunque este caso siempre lo ha de determinar el médico en el momento en que solicita dicha prueba. Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Posteriormente, puede haber una sensación pulsátil. Algunas personas pueden sufrir mareos o desmayos debidos a la impresión que les causa, por lo que se recomienda estar sentado o tumbado durante la extracción.
Primero sacamos 2 mecheros y los colocamos en el campo de esterilizaciónPara inclinar las cajas petris y comenzar a poner las muestras que son las siguientes:
-Orina
-SangreH2o de lechuga
-Raspado de pie
-Muestra interdental
Ya teniendo estas muestras, las colocamos en el medio de cultivo y empezamos abrirlas para colocar las muestras en cada caja petri.
Materiales:
-5 o 7 cajas petri de medio de cultivo.
-Asa bacteriologica
-Vaso de precipitado con 25ml. de agua destilada.
-2 mecheros de bunsen
-Papel para mesa de laboratorio
-Tape
-Algodon secoAlgodones con alcohol
-Tubo conico de plasticoMuestras para siembras:
-Saliva
-Muestra interdental
-Orina
-Agua preparada
-Verduras
-Muestra de sangre
Tecnica de extraccion sanguinea:
Materiales:
-Jeringa 5ml
.-Torundas de algodon alcoholosadas
-Torniquete
Se realiza asepxia y antisepxia del pliegue del brazo utilizando una torunda de algodon con alcohol.Una vez realizado se debe asegurar la aguja a la jeringadandole un pequeño giro hasta que quede apretado. Una vez lista la jeringa y limpia la zona del pliegue se aplica el torniquete en la parte media del brazo para hacer precion t obtener una vaso dilatacion del conducto sanguineo, se intruduce la jeringa y se extraen 2.5ml. de sangre la que depositaremos en un tubo con tapon rojo sin anticuagulante.No se retita el tapon del tubo se introduce la aguja en el.Se deja coagular la sangre y se toma el tiempo se mete a la centrifuga para separar el paquete del plasma.Una vez separado el paquete del plasma se trasvasa a un tubo de ensaye vacio.Se sembrara el liquido plasmatico en medio de cultivo utilizando la tecnica con varilla de cristal denominada siembra por dispercion.
Se esteriliza el producto a 15 tibras de presion y una temperaturade 120 grados centigrados durante 20 minutos.Una vez terminada la esterilizacion se libera del autoclave, se entrega a las mesas y se llenara el vaceado en cajas petri.Para el vaceado en cajas petri se reqiere un campo de esterilizacion en cada mesa y 2 mecreros, para que este en el centro del campo de esterilizacion.Se utiliza caso precipitado de 50 ml. del cual se parara por forma breve en el fuego por la boquilla para que este esterilizado, se le vierte el producto en cantidad requerida y se va a la caja petri dejandola abierta con su tapa sobreencimada hasta que enfrie, esto se da todas las veces necesarias hasta que sea el llenado de capas.Ya estando solido el medio de cultivo se tapa, se etiqueta y se deposita en el enfriados y se etiqueta
MEDIO DE CULTIVO "AZUL DE METILENO"-ESTERILIZACIÓN practica No.1
1-Se debe solicitar en el laboratorio de análisis clínicos un formato para anotar los materiales que se utilizaran en la en la realización de un medio de cultivo. 2-El alumno debe de tener su equipo de bioseguridad completo. 3-vestir la mesa de laboratorio con papel blanco . 4-Una persona del equipo o del equipo debe de verificar que este la linea de gas LP.Para ello se debe de conectar los mecheros y abrir las válvulas que se encuentran de bajo de la meza. 5-Una vez verificado el gas se habilita el equipo de esterilización(AUTOCLAVE)al cual se le debe introducir agua destilada para llevar acabo la esterilización por calor húmedo.
DESARROLLO
Pesamos todos los materiales y para saver cuanto medio de cultivo que vamos a colar en las cajas petri para lo cual tuvimos que hacer una regla de 3: (30)(19)/1000=0.68x7=[4.7], y para preparar el medio de cultivo utilizamos 133 mlde agua destilada y le agragamos los 4.7 grdel medio de cultivo.
Batimos hasta que no quedaran brumos lo batimos con una barrilla de cristal y y prendimos los mecheros y nos colocamos el guante para altas temperaturas de color anaranjado .Hicimos la mezcla con un muñequeosuave a fuego lento hasta que hiciera ebullicion
El objetivo de esta tarea es el de conocer bien las funciones de la cámara de Neubauer y conocer cada tipo de cámara y saber para que se utiliza cada una de estas.
Recuento de electroncitos
Observa que en la gradilla de la cámara de Neubauer las áreas de encuentro de eritrocitos y linfocitos son diferentes. Los glóbulos rojos se encuentran en las áreas coloreadas de rojo, mientras que los glóbulos blancos se encuentran en las áreas de azul, ten en cuenta que la gradilla central tiene 25 cuadros de 1mm x 1mm de área y 0.10mm de profundidad. El factor de dilución es por tanto de 1:200, convierte el numero de glóbulos rojos contados en 5 cuadros al número de glóbulos rojos/ cul. (Microlito)= 1mm
¿Cómo se hace?
·Muy importante:
Cuando un territorio se sitúa en mitad de las líneas superior y/o de la izquierda, entonces es contabilizado 1ero no se sitúa en mitad de las líneas inferior y/o de la derecha.
El rango normal de recuento de glóbulos rojos es el siguiente:
Mujer:3.9-5.6 millones /ud
Hombre:4.5-6.5 millones /ud
Técnicas de contaje celular
Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido. Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión como el porcentaje de estas que son viables.
Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas desde la relativamente simple cámara de contaje celular de la gente existen numerosas variantes entre ellas la que empleamos (cámara de Neubauer), hasta equipos automáticos de contaje celular como el “cell coultor”, de la empresa Beckman Coulter.
Técnicas de cortaje celular
Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido. Habitualmente será necesario deteriorar tanto la densidad de las células en la suspensión como el porcentaje de estas que son viables.
Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas desde la relativamente simple cámara de contaje celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que empleamos (cámara de Neubaver), hasta equipos automáticos de contaje celular como el “cell Coulter”, de la empresa Beckman Coulter.
El principio del contador celular se basa en la medida de los cambios en la resistencia eléctrica que se produce cuando una partícula no conductora en suspensión en un pequeño electrolito atraviesa como pequeño orificio. Como se puede ver en el esquema una pequeña abertura entre los electrodesen.
La zona sensible atraves de la que pasan las partículas que se encuentran en suspensión. Cuando una partícula atraviesa el orificio desplaza su propio volumen de electrolito. El volumen desplazado es medido como un pulso de voltaje.
La altura de cada pulso es proporcional al volumen de la partícula. Controlando la cantidad de la suspensión que circula atraves del orificio es posible contar y medir el tamaño de las partículas. Es posible contar y medir por segundo varios miles de partículas independientemente de su forma, color y densidad.
En la unidad de citrometria de flujo y mocroscopio confocal de los científicos técnicos de la universidad de Barcelona, se dispone de contadores celulares.
Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando métodos mas sencillos. Nos basta con una cámara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensión a medir. El dispositivo presenta una señales que determinan un volumen conocido (x microlito). Al contar debajo de bajo el microscopio de partículas presentes en ese volumen se puede determinar la densidad de partículas en la suspensión de origen.
La cámara de Neubaver es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo cluro o al de contraste de frases. Se trata de un porta objeto con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se han marcado con la ayuda de un diagrama una cuadricula como la que se ve en la imagen. Es un cuadro de3x3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25mm. Así pues el área sombreada y marcada.
La depresión central del cubreobjetos esta hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de la forma que cuando se cubre la superficie marcada 0.1 mly el volumen comprendido entre la superficie2 y el cubre objetos es de 0.1 ml cubico, es decir, 0.1microlitro.
En la imagen puedes observar el aspecto de una de las funciones marcadas con L y que en el microscopio se ve como una cuadricula de 16 pequeños cuadros de 0.25 mm, de lado.
Existen numerosos modelos de cámaras de contaje celular adaptadas en su uso en microscopio en la imagen puede observar una cámara de Neubaver doble, como las que se usan en laboratorio de prácticas. Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El más común es el de “tinción con azul tripan”. El azul tripan es un color que se introduce en el inferior de las células que presentan roturas en la membrana. Así pues, la célula que aparece en la imagen claramente de color azul. Son consideradas no viables. Asimilar células blancas por exclusión a células viables es un error pues por este método se sobre valora la viabilidad de las células en la suspensión determinado como inviable solo aquellas con la membrana rota.
Existen otros métodos de determinación de la viabilidad celular como el más preciso de la tinción con ioduro de propidio.
En la red dispones de descripciones detalladas como la propuesta por P.J. Hansen o la detallada descripción que aporta Beckdickson y los problemas de calculo de parámetros celulares que plantea empleando datos obtenidos a partir de un hemocitometroy otros protocolos para el contaje de células.
1.Se aseptiza el dedo con alcohol y luego se seca al aire o con algodón. Se coge entre el pulgar y el índice y se hace una punción rápida y penetrante a través de la piel de la punta del dedo con una lanceta estéril.
2.Se desecha la primera gota de sangre y se aspira la siguiente con la pipeta de dilución perfectamente limpia y seca hasta la señal 1 o 0.5 (también puede utilizarse la pipeta de hemoglobina, de 20 microlitros). Hay que evitar la entrada de burbujas de aire, pudiendo ayudarnos de un papel de filtro para conseguir el enrasado.
3.A continuación se toma con la pipeta líquido de Hayem, isotónico con la sangre, hasta la señal 1; así, la sangre queda diluida al 1/10, si tomamos sangre hasta la señal 1, o al 1/20 si tomamos hasta 0.5. Esto es así porque el volumen de la bola de la pipeta es 100 veces superior al del capilar de la misma. (Si hemos utilizado la pipeta de hemoglobina podemos diluir su contenido en 2 o 4 ml de líquido de Hayem para obtener diluciones 1/100 o 1/200).
4.Tomamos la pipeta (o el tubo de ensayo) entre los dedos índice y pulgar y agitamos. A través de la goma de conexión con la pipeta, soplamos para despreciar las primeras gotas por corresponder al líquido que estaba en el capilar.
5.Se adapta un cubreobjetos sobre una cámara cuentaglóbulos limpia y seca y se coloca una gota en uno de los lados del cubre; esta gota penetra por capilaridad y rellena el retículo de la misma.
6.. Una vez preparada la cámara se coloca sobre la platina del microscopio dejándose unos minutos en reposo para que sedimenten los glóbulos. Disponemos el condensador bajo y luz débil; enfocamos primero con el objetivo débil seco y luego se cambia al fuerte seco para proceder al recuento, que se lleva a cabo en los cuadrados pequeños del retículo marcado en color rojo. Finalizado el recuento se procede a la limpieza de la pipeta con acético 1:3, agua destilada y alcohol-éter sucesivamente.
7.El volumen de sangre en el cual se han contado las células resulta de multiplicar la profundidad de la cámara por el factor de dilución, la superficie de los cuadrados y el número de cuadrados contados.
Con cámara de NEUBAUER: Superficie de 1 cuadrado grande (1/20 mm de lado):
Volumen de un cuadrado grande (1/10 mm de profundidad):
Si contamos "a" glóbulos rojos en "n" cuadrados pequeños, el número de glóbulos por cuadrado será a/n.
Si en un volumen 1/4000 mm3 hay a/n glóbulos rojos, en 1 mm3 habrá X. Luego:
siendo X el número de glóbulos rojos existentes por cada mm3 de sangre diluida.
Si la sangre se diluyó a 1/100 o 1/200, habrá que multiplicar el valor X por 100 o 200 respectivamente, con lo cual obtendremos un nuevo valor, Y, que representa el número de glóbulos rojos existentes por cada mm3 de sangre (sin diluir).
1.
a)se pipetea una suspensión de células en el porta, en el borde del cubre, rellenando la cámara de recuento por capilaridad. En unos minutos sedimentan las células en el fondo y se puede empezar en recuento.
b)Se cuentan las células bacterianas de uno de los 25 cuadros de mayor tamaño; en este caso solo hay 12 bacterias. En la practica se cuentan las bacterias de varios grandes y se hace la medida. El numero en el cuadro grande multiplicado por 25 es el numero en 0.02mm cubicos. El numero multiplicado por 50 es el numero en 1 mm cubico. Este numero multiplicado por 100 es el numero en un mililitro (un centímetro cubico). En este caso :12x25x50x1000=1.5x10(cubico)células/ml. Si se encuentran las células de un cuadrado pequeño, el numero se multiplica por un factor de 16(16x25x50x100=20000000).
c)Se utilizan para calcular, mediante el uso del microscopio, el número de partículas (leucocitos, hematíes, bacterias…) por unidad de voluimen de un líquido.
d)La cámara está constituida por una placa base de vidrio especial parecido a un porta, su parte central se encuentra separada de los extremos por unas ranuras. en ella se encuentran las cuadrículas de recuento.
e)La fórmula de contaje es: partículas/mm3= partículas contadas.
Clases de cámaras
- Neubauer improved: Es el más utilizado (9 cuadros grandes, cada 1 de 1 mm2.)
- Neubauer: La diferencia es el cuadro grande central.
- Thoma: Se utiliza solo para el recuento de eritrocitos.
- Fuchs-Rosenthal:Se utiliza habitualmente para recuento de células en líquidos orgánicos (LCR, Líquido sinovial…)
Cámara de Neubauer.
Es un instrumento utilizado en cultivo celular para realizar conteo de células en un medio de cultivo líquido.
Consta de 2 placas de vidrio, entre las cuales se pueden alojar un volumen conocido de liquido. Una de las placas posee una grilla de dimensiones conocidas y que es visible al microscopio óptico. Para contar las células de un cultivo liquido se agrega una gota de este eutre, estas dos plásticas y observar al microscopio óptico la cantidad de células presentes en un campo determinado de la grilla.
En base al a cantidad de células contadas conocidas, el volumen de liquido que admite el campo de laq grilla se calcula la concentración de células por unidad de volumen de la solución de medio de cultivo inicial.
Se usa para el recuento de leococitos y de glóbulos rojos.
Para la pipeta para blancos con sangre capilar anticuagulada se diluye la muestra con el liquido y se deja reposar 10 min. Para que se homolicen los eritocitos, se llenan ambos lados de la cámara, se enfoca con poco aumento los leucocitos aparecen con continuos celulares cloros y núcleos bien definidos.
Para poder realizar las practicas el alumno debe contar con su equipo de bioseguridad como es; bata blanca, gorro, cubre bocas y guantes de látex desechables.
Bibliografía
La mando el profesor Manuel Alfaro por correo electrónico 26-03-09.
